TEV重组蛋白酶在大肠杆菌中的异源表达

赵中先

摘要：本实验主要研究的是利用大肠杆菌异源表达TEV重组蛋白酶，通过平板划线、重组菌落的活化、目的基因的诱导、细胞的破碎技术和目的蛋白的纯化等技术获得重组蛋白，并进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE检测分析结果表明在相对分子质量约为27Kda处发现TEV蛋白酶。通过本实验，我们掌握了对已知目的蛋白基因的蛋白质进行大量制备的方法，这为解决人类对特异蛋白的高需求量的问题，推动了科技的进步，为蛋白质组学的发展奠定了基础。

关键词 TEV重组蛋白  大肠杆菌表达系统  蛋白质纯化技术  

前言

1. TEV蛋白酶介绍

烟草蚀斑病毒( Tobacco etch virus ，TEV) 酶是相对分子质量为27 kDa的催化结构域的通用名称，TEV蛋白酶与肠激酶U (EK)、Thrombin、 Factor Xa、 SUMO等蛋白酶相比，具有高活性、高特异性的双重特点[1] 。但是天然的TEV蛋白质产量低、提取复杂，不能满足于人类对其高需求的要求，随即对TEV蛋白酶（重组型）的研发成为了重点。

TEV蛋白酶（重组型）是经过基因工程改造后的重组蛋白酶，该酶特异性识别Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe- Gln-Gly七氨基酸序列，切割位点位于Gln-Gly之间[2] 。TEV蛋白酶因具有高剪切活性和特异性，已成为融合蛋白表达后去除融合tag的首选蛋白酶。该酶经6×His标签纯化而得（含组氨酸标签），纯度达99％，剪切反应完毕后可通过Ni-NTA Resin去除。该酶在4℃-30℃温度、pH范围（6.0-8.5）反应条件下均具有活性（见下表）。

表1 不同温度下TEV蛋白酶的剪切活性

不同温度下剪切活性(%)
	4℃	16℃	21℃	30℃
0.5h	34	58	56	70
1h	58	80	78	90
2h	71	99	99	99
3h	84	99	99	99

重组型烟草蚀斑病毒（TEV)酶可用于研究膜蛋白的跨膜结构，应用拓扑学分析进行研究，烟草蚀斑病毒(TEV)酶特异性切割测试蛋白中跨膜片段的前段或后端所插入的TEV识别序列EXXYXQ(S/G)。如果TEV酶能够切割，表明该序列位于目标蛋白的细胞质外[3]。将TEV识别序列ENLYFQG分别插入到拟南芥整合膜蛋白的的跨膜区域，然后转化进入酿酒酵母中，消解酶(zymolyase)酶破除酵母的细后，TEV酶消化球状体，最后通过Western免疫印迹法来分析结果。从而实现对膜蛋白的跨膜结构的研究[3]。

2. 大肠杆菌表达系统介绍

在蛋白质的表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统[4]。

对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致[5]。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体[6]。

大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等[4]。在本次试验中，我们就采用了大肠杆菌表达系统对蛋白质进行表达。

3. 蛋白质纯化技术

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质[7]。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品[8]。用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品[9-11]。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

综上所述，首先把目的蛋白基因提取出来，然后利用质粒将目的基因进行重组，接着运用生物技术把目的基因导入大肠杆菌，把重组菌置于适宜的环境中进行培养，利用IPTG诱导重组菌的蛋白质表达，然后用水浴加热的方法把重组菌充分的破碎，最后依次进行目的蛋白的纯化和SDS-PAGE 电泳，从而得到目的蛋白的图像并分析。

1 实验材料：

1.1 菌种    TEV重组菌株，实验室保存。

1.2 培养基

LB培养基：

酵母菌提取物 0.5%，胰蛋白胨 1.0%，NaCl 1.0%，PH 7.0。用于E.coli 液体培养，固体培养基加琼脂1.5%，需要时加适当浓度抗生素。

1.3 试剂

氨苄青霉素、IPTG、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、TEMED、SDS、过硫酸铵、甘氨酸、考马斯亮蓝R-250、乙醇、冰醋酸、蛋白Marker 5只（50 μl装）

1.4 溶液

1.4.1 IPTG溶液

用蒸馏水溶解IPTG配制浓度为0.2 mol／L，10 mL的溶液，过滤除菌后与－20℃避光保存。

1.4.2 亲和层析缓冲液

His-Bind Buffer：

Binding Buffer（10 mmol／L 咪唑；0.5 mol／L NaCl；20 mmol／L Tris-HCl  PH 8.0）

Washing Buffer （80 mmol／L 咪唑；0.5 mol／L NaCl；20 mmol／L Tris-HCl  PH 8.0）

Eluting Buffer （250 mmol／L 咪唑；0.5 mol／L NaCl；20 mmol／L Tris-HCl  PH 8.0）

1.4.3 50％酒精 400 mL

1.4.4 10 g／L Na2CO3溶液 400 mL

1.4.5 1 mmol EDTA 400 mL

1.4.6 SDS-PAGE 电泳缓冲液 (1×)

25 mmol∕L Tris-HCl; 250 mmol∕L 甘氨酸; 0.1﹪ SDS; PH 8.3

1.4.7 蛋白质样品处理液（2×）

1.4.8 1M  Tris (PH6.8) 500 mL

1.4.9 1.5M  Tris (PH8.8) 500 mL

1.4.10 10%SDS 200 mL

1.4.11 10%过硫酸铵 10 mL

1.4.12 30% Acr-Bis 100 mL

1.4.13 考马斯亮蓝染色液 

    考马斯亮蓝R-250 0.29 g，加水溶解至250mL

1.4.14 考马斯亮蓝脱色液 

乙醇250 mL，冰醋酸 80 mL，加水至500 mL

1.5 亲和层析介质

EzEast Ni FF

1.6 主要仪器设备

1.6.1 低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂，TDL-60B型

1.6.2 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司，T6新世纪

1.6.3 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限责任公司，AL 204

1.6.4 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂， YXQ-LS-SⅡ

1.6.5 SHJ系列超净工作台：上海汇龙仪表电子有限责任公司环境工程装备分公 司，CA-1480-Ⅱ

1.6.6 数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂，GZX-9070MNE

1.6.7 数显恒温振荡摇床：常州市华普达教学仪器有限公司，BS-1E

1.6.8 生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂，SPX-250B-Z型

1.6.9 电冰箱Hisense：海信（北京）电器有限公司，BCD-251U

1.6.10 架盘天平：天津市天马仪器厂，HC-TP-12型

1.6.11 灶头（黑晶炉）：奔腾电器（上海）有限公司，PL01

1.6.12 恒流泵，上海沪西分析仪器厂有限公司，HL-2

1.6.13 紫外检测仪，上海沪西分析仪器厂有限公司，HD-3

1.6.14 稳压电泳仪，北京市六一仪器厂，DYY-1A

1.6.15 脱色摇床，常州市华普达教学仪器有限公司，TS-1